瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒
Midi Purification Kit
保存條件：本試劑盒在室溫儲存 18 個月不影響使用效果。
產(chǎn)品介紹：
在高離序鹽存在的情況下，DNA 片斷選擇性的吸附于離心柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜上，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，漂洗液將引物、核苷酸、蛋白、酶等雜質(zhì)去除，后用低鹽、高 pH 值的洗脫緩沖液將純凈 DNA 從硅基質(zhì)膜上洗脫。產(chǎn)品特點(diǎn)：
1. 離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好。克服了國產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。
2. 使用了溶膠液，不含傳統(tǒng)溶膠液的碘化那鈉和高氯酸鹽，不抑制回收后酶切、連接克隆等下游反應(yīng)。
3. 溶膠液調(diào)制成為了黃顏色，便于觀察溶膠效果和監(jiān)測 pH 值變化從而達(dá)到理想結(jié)合效果，大大提高回收效率。
注意事項:
1. 所有的溶液應(yīng)該是澄清的，如果環(huán)境溫度低時溶液可能形成沉淀，此時不應(yīng)該直接使用，可在 37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。使用前應(yīng)該恢復(fù)到室溫。
2. 儲存于低溫（4℃或者-20℃）會造成溶液沉淀，影響使用效果，因此運(yùn)輸和儲存均在室溫下（15℃-25℃）進(jìn)行。
3. 避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH 值變化，各溶液使用后應(yīng)及時蓋緊蓋子。
4. 溶膠液中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要立即用大量清水或者生理鹽水沖洗。
5. 回收純化的DNA片段一般在100bp到40kb之間，過長、過短片段的回收效率降低。
6. 回收DNA的量和起始DNA的量、洗脫體積、DNA片斷大小有關(guān)。一般1-20μg， 100bp-5kb的DNA片段，回收率可高達(dá)85%-95%。
7. 切膠回收時，紫外燈觀察對DNA片段有損壞作用，應(yīng)該盡可能使用能量低的長波紫外線，并且盡可能的縮短紫外線下處理的時間。
8. pH值≤7.5時，吸附膜吸附DNA的效率高如果切下來的凝膠中含有電泳緩沖液太多，造成溶膠后溶膠液pH偏高，會導(dǎo)致回收率降低。溶膠后，如果溶膠液依舊保持黃色，說明pH正常；如果變成橘紅色或者淡紫色，說明pH偏高，可在膠充分溶解后加5-10μl3M醋酸鈉（pH5.2）將pH值調(diào)到5-7（黃色）。
9. 洗脫液EB不含有螯合劑EDTA， 不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗脫， 但應(yīng)該確保pH大于7.5， pH過低影響洗脫效率。用水洗脫，DNA片段應(yīng)該保存在-20℃。DNA片段如果需要長期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl，1mM EDTA， pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應(yīng)，使用時可以適當(dāng)稀釋。
自備試劑：無水乙醇操作步驟：
提示：次使用前請先在漂洗液 WB 中加入量無水乙醇，加入后請及時打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!
1. 在長波紫外燈下，用干凈刀片將所需回收的 DNA 條帶切下，盡量切除不含 DNA 的凝膠，得到凝膠體積越小越好。
2. 將切下的含有 DNA 條帶凝膠放入 1.5ml 離心管，稱重。
3. 加 3 倍體積溶膠液 DD。（凝膠重為 100mg，則加入 300μl 溶膠液）
如果凝膠濃度大于 2％，應(yīng)加入 6 倍體積溶膠液。
4. 56℃水浴放置 10min（或直至膠*溶解）。每 2-3min 渦旋震蕩一次加速溶解。
5. 可選,：每 100mg 初的凝膠重量加入 150μl 的異丙醇，震蕩混勻。
6. 將上一步所得溶液加入吸附柱 EC 中（吸附柱放入收集管中），室溫放置 1min，12,000rpm 離心 30-60sec，倒掉收集管中的廢液。
7. 加入 500μl 漂洗液 WB （請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心 30sec，棄掉廢液。
8. 重復(fù)操作步驟 7。
9. 將吸附柱 EC 放回空收集管中，12,000rpm 離心 2min，盡量去除漂洗液，以免漂洗液中殘留的乙醇抑制下游反應(yīng)。
10 取出吸附柱 EC，放入一個干凈的離心管中，室溫放置數(shù)分鐘。
11.在吸附膜的中間部位滴加洗脫緩沖液 EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中加熱效果更好），室溫放置 2min，12,000rpm 離心1min。如果需要較多量 DNA，可將得到的溶液重新加入吸附柱中，離心 1min。(注意：洗脫體積不應(yīng)小于 30μl，體積過少影響回收效率)
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