血液RNA提取試劑盒說明書

RNApure Blood Kit

 Cat. No.   K0582

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組分說明

                                           Cat. No.                 K0582

                                            Kit Size                  50

                                      Buffer RBL（10×）             60 ml

                                           Buffer RL                  35 ml

                                         Buffer RW1                  40 ml

                                 Buffer RW2（concentrate）             11 ml

                                      RNase-Free Water                10 ml

                                    Shredder Spin Column               50

                                       Spin Column RM                50

                                  Collection Tube（1.5 ml）             50

                                   Collection Tube（2 ml）              100

產品簡介

    本試劑盒適用于從新鮮全血（用檸檬酸鹽、EDTA 或肝素等抗凝劑處理過的血液樣品）中提取總  RNA，可以處理多至1.5  ml 的全血，洗脫得到分子量大于 200 bp 的高純度 RNA，多個樣品可以在 1 小時內同時完成。本產品無需 CsCl 純化的超離心步驟和 LiCl 或乙醇沉淀，不含有苯酚或氯仿等有毒溶劑，經過純化的 RNA 有效去除血紅素、肝素等酶抑制劑和污染物，可直接用于各種分子生物學常規實驗，如 RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、體外翻譯等實驗。

注意事項

1.  預防 RNase 污染，應注意以下幾方面：

1）  使用無 RNase 的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。

2）  玻璃器皿應在使用前于 180℃高溫下干烤 4 小時，塑料器皿可在 0.5M NaOH 中浸泡 10 分鐘，用水*沖洗后高壓滅菌。

3）  配制溶液應使用無 RNase 的水。

4）  操作人員戴一次性口罩和手套，實驗過程中要勤換手套。

2.  樣品應避免反復凍融，否則影響提取 RNA 提取得率和質量。樣品在 Buffer RL 中，可于-70℃保存一個月。

3.  使用前請檢查 Buffer RL 是否出現結晶或者沉淀，可置于 56℃水浴重新溶解。Buffer RL 在使用前請加入β-巰基乙醇，

    至終濃度為 1%。如 1 ml Buffer RL 加 10 μl  β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的 Buffer RL 室溫可保存 1 個月。

4.  第一次使用前應按照試劑瓶標簽的說明先在 Buffer RW2 中加入無水乙醇。

5.  本試劑盒不能用于加入抗凝劑的冷凍血液樣本 RNA  的提取。

6.  10×Buffer RBL 需在使用前將溶液用無 RNase 的水進行 10 倍稀釋，稀釋后置于 2-8℃保存。

7.  若下游實驗對 DNA 非常敏感，建議用不含 RNase 的 DNase I（貨號：K2090A）對 RNA 進行處理。

自備試劑：  β-巰基乙醇、70%乙醇（用無 RNase 的水配制）、無水乙醇  

操作步驟

1.  向0.5-1.5 ml 新鮮的抗凝全血樣本中，加入5倍體積的1×Buffer RBL（請于使用前用無RNase的水將10×Buffer RBL 稀釋10倍），輕輕渦旋或顛倒混勻。冰上孵育10-15分鐘，孵育過程中混勻兩次。

    注意：孵育過程中渾濁的懸液會變成透明，證明紅細胞被裂解，必要時可以把孵育時間延長至20分鐘。

2.  4℃  2,100 rpm（~400×g）離心10分鐘，小心吸棄上清。

3.  向以上沉淀中加入2倍血液樣本體積的1×Buffer  RBL（請于使用前用無RNase的水將10×Buffer RBL稀釋10倍），輕輕渦旋，充分重懸沉淀。

4.  4℃  2,100 rpm離心10分鐘，小心并*吸棄上清。

    注意：此步一定要*去除上清否則影響裂解導致RNA產量下降。

5. 向沉淀中加入Buffer RL（使用前檢查是否已經加入β-巰基乙醇），0.5-1.5 ml血液樣本加入600  μl Buffer RL，或小于0.5 ml  血液樣本加入350 μl Buffer RL，混勻。

6.將所得液體轉移到已裝入收集管（Collection Tube 2 ml）的過濾柱（Shredder Spin Column）中，12,000 rpm（~13,400×g）離心2分鐘，收集濾液，棄掉過濾柱。

7.向所得濾液中加入1倍體積（600  μl或350 μl）的70%乙醇（無RNase水配制），混勻。

    注意：加入乙醇后可能會產生沉淀，不會影響后續實驗。

8.將上步所得溶液全部加入到已裝入收集管（Collection Tube 2 ml）的吸附柱（Spin Column RM）中，若一次不能加完溶液，可分多次轉入。12,000 rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

9.  向吸附柱中加入700  μl Buffer RW1，12,000 rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

    可選步驟：如果要進行對微量DNA非常敏感的RNA實驗，則用以下步驟替代步驟9。

    1）向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1, 12,000 rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

    2）配制DNase I  混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8  μl 10×Reaction Buffer 和20  μl DNase I（1 U/μl），混勻，  配制成終體積為80  μl 的DNase I混合液。

       注意:  以上體系為按照我公司產品DNase I （K2090A）反應體系進行配置，應用其他公司產品請參考相應說明書。

    3）向吸附柱中直接加入80 µl DNase I混合液，20-30℃孵育15分鐘。

    4）向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1, 12,000 rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

10.  向吸附柱中加入500  μl Buffer RW2（使用前檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

11.  重復步驟10。

12.  12,000 rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數分鐘，以*晾干。

    注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續的酶促反應（酶切、PCR  等）。

13.  將吸附柱置于一個新的無RNase離心管（Collection Tube 1.5 ml）中，向吸附柱的中間部位加入30-50 μl RNase-Free

    Water，室溫放置1分鐘，12,000 rpm離心1分鐘，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

注意：1）RNase-Free Wate體積不應小于30  μl，體積過小影響回收率。

2）如果要提高RNA的產量，可用30-50  μl新的RNase-Free Water重復步驟13。

3）如果要提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復步驟13。

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