甲基化DNA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

DNA Methylation Kit

目錄號(hào)：K2140

保存：室溫

組分說(shuō)明

Cat. No.                        K2140               K2140A

Kit Size                          10                    50

CT Conversion Reagent             10 reations          50 reations

M-Dissolving Buffer          10 reations（100 μl）     50 reations（粉末）

M-Dilution Buffer                  400 μl               2 ml

M-Buffer PA                       15 ml                60 ml

M-Wash Buffer（concentrate）        2 ml                 15 ml

M-Elution Buffer                    1 ml                 10 ml

Buffer PS                          5 ml                 15 ml

Spin Column DS                     10                  50

Collection Tube（2ml）               10                  50

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

    本試劑盒采用高溫處理方法，縮短了轉(zhuǎn)變時(shí)間，提高了轉(zhuǎn)變效率，轉(zhuǎn)變效率可達(dá)到 99%以上。經(jīng)過(guò) DNA亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變，可回收得到大量 DNA。本試劑盒基本原理為 DNA 經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后，可使未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>

尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。

    本試劑盒采用硅基質(zhì)膜式純化柱通過(guò)簡(jiǎn)單的結(jié)合-洗滌-洗脫步驟，可從甲基化修飾后的溶液中回收純化 DNA，回收的DNA 純度高，完整性好，可直接用于測(cè)序、甲基化 PCR 檢測(cè)、芯片分析、連接和轉(zhuǎn)化、酶切、標(biāo)記、顯微注射、PCR 和體外轉(zhuǎn)錄等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

注意事項(xiàng)

1.   產(chǎn)品配用方法：

（1）10次包裝配制方法：CT Conversion Reagent是固體混合物，一定要在第—次使用前制備好。將2 ml  無(wú)菌水、100μl M-Dissolving Buffer和300  μl M-Dilution Buffer加入到CT Conversion Reagent管中。 在55°C溶解并震蕩直至全部溶解。在使用之前將 CT Conversion Reagent 溶液在室溫(20°C -30°C)下避光保存。每管的CT Conversion Reagent是針對(duì)10次DNA 處理設(shè)計(jì)的，為了得到較好的結(jié)果, CT Conversion Reagent應(yīng)當(dāng)在制備后立即使用，如果不立即使用，可將CT Conversion Reagent  溶液在-20°C存儲(chǔ)1周，使用前，請(qǐng)務(wù)必將存儲(chǔ)的CT Conversion Reagent 溶液在室溫下解凍，并且通過(guò)振動(dòng)或顛倒2分鐘以充分混勻，CT Conversion Reagent對(duì)光很敏感，所以要盡量減少在光下的暴露。

（2）50 次包裝配制方法：CT Conversion Reagent、M-Dissolving Buffer 均固體混合物，一定要在第—次使用前制備好。將 5ml 無(wú)菌水加入到 M-Dissolving Buffer 中震蕩溶解，待固體全部溶解后將 M-Dissolving Buffer 管中溶液全部轉(zhuǎn)移至CT Conversion  Reagent 管中同時(shí)補(bǔ)加 5.5ml 無(wú)菌水。再將 1.5ml M-Dilution Buffer 加入到 CT Conversion  Reagent

管中。在 55°C 溶解并震蕩直至全部溶解。在使用之前將 CT Conversion Reagent  溶液在室溫 (20°C -30°C)下避光保存。每管的  CT Conversion Reagent 是針對(duì) 50 次 DNA  處理設(shè)計(jì)的，為了得到較好的結(jié)果, CT Conversion Reagent 應(yīng)當(dāng)在制備后立即使用，如果不立即使用，可將  CT Conversion Reagent 溶液在-20°C 存儲(chǔ) 1 周，使用前，請(qǐng)務(wù)必將存儲(chǔ)的 CT Conversion Reagent 溶液在室溫下解凍，并且通過(guò)振動(dòng)或顛倒 2 分鐘以充分混勻，CT Conversion Reagent 對(duì)光很敏感，所以要盡量減少在光下的暴露。

2.  第一次使用前應(yīng)安裝試劑瓶標(biāo)簽的說(shuō)明先在M-Wash Buffer中加入無(wú)水乙醇。

自備試劑：無(wú)水乙醇、75%乙醇

操作步驟

每次制備的 DNA 范圍在  1 ng-4  μg 之間，最佳量為 500 ng-2μg。

1. 取 20 μl DNA 樣品，加入到離心管（自備）中，如果樣品量不足，用水補(bǔ)至 20μl。

2. 向 DNA 樣品中加入 2.2 μl  的 M-Dilution Buffer，混勻樣品。

3. 42℃水浴 30 分鐘。

4. 向上步得到的樣品中，加入 220 μl 配制好的  CT  Conversion  Reagent 溶液，混勻，80℃恒溫水浴鍋中避光孵育 60分鐘。

5. 向上步溶液中加入 480 μl M- Buffer PA，溫和上下顛倒混勻。

6. 柱平衡：向已裝入收集管（Collection Tube）的吸附柱（Spin Column CS）中加入 200  μl Buffer PS，12,000 rpm（~13,400×g）離心 2 分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

7. 將步驟 5 所得溶液全部加入到吸附柱（已裝入收集管）中，室溫放置 2 分鐘，12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

   注意：吸附柱最大容量為700  μl，若樣品體積大于700 μl可分批加入  。

8. 向吸附柱中加入 500 μl M- Buffer PA，12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉收集管中的廢液，  將吸附柱放回收集管中。

9. 向吸附柱中加入 650 μl  M-Wash Buffer（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

10. 12,000 rpm 離心 2 分鐘，倒掉廢液，將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以*晾干。

   注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余乙醇去除，乙醇?xì)埩魰?huì)影響后續(xù)的酶促反應(yīng)（酶切、PCR等）

11. 將吸附柱放入一個(gè)新的離心管（自備）中，向吸附膜中間位置懸空滴加 20 μl M-Elution Buffer（pH  8.5），室溫放置 2 分鐘。12,000 rpm 離心 1 分鐘收集 DNA 溶液。

12. 向收集的 20 μl DNA 中加入 2.2  μl M-Dilution Buffer，室溫靜止 30 分鐘。

13. 向溶液中加入 500 μl 預(yù)冷的無(wú)水乙醇顛倒混勻，沉淀 30 分鐘（建議置于-20℃沉淀，過(guò)夜沉淀效果更好）。

14. 12,000 rpm 離心 15 分鐘，輕輕倒掉上清，再用 75%乙醇洗滌一次。

15. 12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉上清，室溫下待乙醇揮發(fā)后，加入 20 μl M-Elution Buffer 溶解，DNA 置于-20℃保存。此步收集的 DNA 可以用于后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

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