2×GoldStar Best MasterMix（含染料）說明書

目錄號：K0655

保存條件：-20℃長期保存，如需頻繁使用，可存放于2-8℃，盡量避免反復凍融。

組分說明

               Cat. No.                       K0655      K0655B

               Kit Size                         1 ml       5×1 ml

               2×GoldStar Best MasterMix        1 ml       5×1 ml

               RNase-Free Water                 1 ml       5×1 ml

           注意：2×GoldStar Best MasterMix含有GoldStar  Best DNAPolymerase,

                2×GoldStar Best PCR  Buffer, 3 mM MgCl2和400 µM  dNTPs。

產品簡介

　　本品為由GoldStar Best  DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg、dNTPs以及PCR穩定劑和增強劑組成的預混體系，濃度為 2×，具有操作簡便快速、靈敏度高、特異性2+強、穩定性好的優點，可最大限度地減少人為誤差和污染。該產品所含的GoldStarBest DNA Polymerase是經過特殊處理的熱啟動高保真聚合酶。該聚合酶具有5′-3′DNA聚合酶活性， 5′-3′核酸外切酶活性和  3′-5′核酸外切酶活性，在普通PCR條件下，與GoldStar Taq DNA Polymerase相比，具有擴增效率高、錯配率低的優良性能。化學修飾使該酶在常溫下沒有聚合酶活性，有效避免在常溫條件下由引物和模板非特異性結合或引物二聚體而產生的非特異性擴增，酶的激活須在 95℃下孵育10分鐘，該條件可以整合入已有的PCR熱循環程序。優化的緩沖體系使酶的作用發揮最大功效，實現對目的片段的高保真、高特異性、高擴增效率、高靈敏度擴增。本產品已加入染料（藍色），反應結束后可直接進行電泳檢測，無需再使用上樣緩沖液。擴增得到的PCR產物3′端附有一個“A"堿基，因此可直接用于T/A克隆。適用于常規的PCR反應和對高保真性有要求的基因克隆等實驗。

質量控制

　　經檢驗無外源核酸酶活性； PCR方法檢測無宿主殘余DNA；能有效地擴增多種基因組中的單拷貝基因；2-8℃存放三個月，活性無明顯改變。

                本產品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途

    使用方法

    以下舉例為常規PCR反應體系和反應條件，實際操作中應根據模板、引物結構和目的

    片段大小不同進行相應的改進和優化。

    1. PCR反應體系

              試劑                             50 μl反應體系       終濃度

              2×GoldStar Best MasterMix          25 μl                                   1×

              Forward Primer，10 µM                2 μl                                 0.4 μM

              Reverse Primer，10 µM                2 μl                                  0.4 μM

              Template DNA                              <1 μg        <1 μg/reaction

              RNase-Free Water                 up to 50 μl

       注意：引物濃度請以終濃度0.1-1.0 μM作為設定范圍的參考。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發生非特異性反應時，可降低引物濃度，由此優化反應體系。

    2. PCR反應條件

步驟                 溫度              時間

預變性                95℃            10 min

變性                 94℃             30 s

退火                55-65℃            30 s     30-40個循環

延伸                 72℃              60 s

終延伸               72℃             5 min

注意：1）一般實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃，無法得到理想的擴增效率時，適當降低退火溫度；發生非特異性反應時，提高退火溫度，由此優化反應條件。

2）延伸時間應根據所擴增片段大小設定，本產品中所包含的GoldStar Best DNA Polymerase的擴增效率為1 kb/min。

3）可根據擴增產物的下游應用設定循環數。如果循環次數太少，擴增量不足；如果循環次數太多，錯配機率會增加，非特異性背景嚴重。所以在保證產物得率的前提下應盡量減少循環次數。

4）本產品須在預變性95℃，10 min條件下實現酶的活化。

3.結果檢測：本產品已加入染料（藍色），反應結束后取5  µl反應產物直接進行瓊脂糖

      凝膠電泳檢測，無需再使用上樣緩沖液。

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