HiFi-MMLV cDNA*鏈合成試劑盒說明書

HiFi-MMLV cDNA Kit

目錄號：YJ0744

保存條件：-20℃保存。

組分說明

             Cat. No.                   YJ0744      YJ0744A

             Kit Size                      25          100

             HiFi-MMLV，200 U/μl          25 μl        100 μl

             5×RT Buffer                 120 μl       500 μl

             Primer Mix                  60 μl        240 μl

             dNTP Mix，2.5 mM Each        120 μl       500 μl

             DTT，0.1 M                   60 μl        240 μl

             RNase-Free Water             1 ml         1 ml

             本產品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途  

產品簡介

　　本產品是專為兩步法RT-PCR*步實驗配制的cDNA*鏈合成試劑盒。本產品包

含從RNA模板逆轉錄成cDNA*鏈所需的所有試劑，其中包括HiFi-MMLV逆轉錄酶、

反應緩沖液、引物、dNTP等。經過突變改造的HiFi-MMLV逆轉錄酶RNase H活性缺失，

減少了逆轉錄反應中RNA的降解，更容易獲得全長的cDNA。HiFi-MMLV逆轉錄酶熱穩

定性強，可得高產量的 cDNA，使用簡單方便。本系統對后續的  PCR以及定量PCR試

驗兼容性高，適用各種PCR反應的DNA聚合酶。

產品特點

·RNase H-：經突變的HiFi-MMLV逆轉錄酶，RNase H活性缺失，更易獲得全長cDNA。

·使用方便：試劑盒包含除RNA模板外的逆轉錄所需全部試劑。

注意事項

1．在操作過程中應避免RNase污染，防止RNA降解或實驗中的交叉污染，建議在專門

   的區域進行RNA操作，使用專門的儀器和耗材，操作人員帶口罩和一次性手套并經

   常更換手套。

2．實驗盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，應使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙

   酯）水溶液在37℃處理12小時，并在120℃下高壓滅菌30分鐘后使用，或者將玻璃

   器皿在180℃下干熱滅菌60分鐘后使用。實驗中用到的無菌水應使用 0.1%的DEPC

   處理后進行高壓滅菌。

3．本試劑盒中的所有試劑使用前請上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經短暫離心

   后使用。所涉及的酶類使用后應盡快放回-20℃，避免反復凍融。

4．若起始RNA的量小于50  ng，建議加入RNA酶抑制劑（RNasin）。本試劑盒并未提

   供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：YJ0596。

使用方法

注意：10 ng-5 μg總RNA可建立20 μl反應體系，如果總RNA量大于5 μg，請按比例擴大反應體系。

 i逆轉錄操作步驟：

1．將RNA模板、引物、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFi-MMLV和RNase-Free Water 

   溶解并置于冰上備用。

2．根據以下表格配制反應體系，總體積為20 μl。

試劑                    20 μl反應體系             終濃度

dNTP Mix，2.5 mM Each               4  μl         500 μM Each

Primer Mix                         2  μl

RNA Template                       X  μl           1 ng-5 μg

5×RT Buffer                        4  μl              1×

DTT，0.1 M                          2  μl            10 mM

HiFi-MMLV，200 U/μl                 1  μl

RNase-Free Water               up to 20  μl

    注意：1）若起始RNA的量小于50 ng，則建議加入RNA酶抑制劑（RNasin）。本試劑盒并未提供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：YJ0596。

    2）Primer Mix由Oligo(dT)和Random Primer配制而成。

3．渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。

4．42℃孵育30-50分鐘，85℃孵育5分鐘。反應結束后，短暫離心，置于冰上冷卻。

5．逆轉錄產物可直接用于PCR反應和熒光定量PCR反應，或置于-20℃長期保存。

ii  若逆轉錄效率低，或RNA模板二級結構復雜、GC含量高時，建議采用以下步驟：

1．將RNA模板、引物、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFi-MMLV和RNase-Free Water 

   溶解并置于冰上備用。

2．根據以下表格配制反應體系，總體積為13 μl。

試劑                        20 μl反應體系             終濃度

dNTP Mix，2.5 mM Each               4  μl         500 μM Each

Primer Mix                         2  μl

RNA Template                       X  μl           1 ng-5 μg

RNase-Free Water               up to 13  μl

3．70℃孵育10分鐘，迅速冰浴2分鐘。

4．短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。

5．繼續向以上反應液中加入以下試劑：

試劑               20 μl反應體系          終濃度

5×RT Buffer           4 μl            1×

DTT，0.1 M             2 μl          10 mM

        注意：1）若起始RNA的量小于50 ng，則建議加入RNA酶抑制劑（RNasin）。本試劑盒并未提供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：YJ0596。

        2）Primer Mix由Oligo（dT）和Random primer配制而成。

6．輕輕吹打混勻，42℃孵育2分鐘。

7．加入1 μl HiFi-MMLV（200 U/μl），輕輕吸打混勻。42℃孵育50分鐘。

8．85℃孵育5分鐘。反應結束后，短暫離心，置于冰上冷卻。

9．逆轉錄產物可直接用于PCR反應和熒光定量PCR反應，或置于-20℃長期保存。

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